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夏宁邵教授团队发现尿液中pORF2蛋白是戊型肝炎病毒诊断的优异靶标

日期: 2022-09-20 访问数:

戊型肝炎病毒(Hepatitis E Virus,HEV)是全球范围内病毒性肝炎最主要的病原体之一。慢性肝病患者、孕妇、老年人是HEV感染的高危人群。慢乙肝患者重叠感染戊肝后,肝衰竭发生风险升高至10.9倍,死亡风险升高至8.54倍。有报道显示孕妇特别是妊娠晚期孕妇的病死率高达15-25%,且死胎率、早产率高。老年人感染HEV容易导致重型肝炎,占比达14%。近年来的研究还显示器官移植等免疫抑制人群感染HEV还可能导致慢性化肝炎,加快肝硬化进展(约10%)。此外,研究还表明HEV感染会导致多种肝外临床表现,显示出包括神经系统、泌尿系统等多种肝外疾病伴随转氨酶异常。同时,多项血液中心研究结果均提示无症状的隐性HEV携带者正在给输血安全带来新的挑战。

戊肝的临床诊断主要依赖于宿主抗体免疫应答检测和病毒核酸检测等诊断方法。作为RNA病毒,HEV的核酸检测存在操作复杂、成本高、易污染等问题,目前国内戊肝诊断常用的指标是HEV IgM的检测,临床上尚普遍缺乏简单易行的病原体检测手段。夏宁邵教授团队前期围绕戊肝诊断新方法展开研究并取得了一系列成果,发现了HEV在复制过程中编码病毒衣壳抗原的orf2基因会同时编码一个分泌型的蛋白pORF2S,pORF2S大量释放到细胞外并进入血液循环中,其血液中含量可达病毒衣壳粒子的近1000倍。并且在此基础上改进了HEV抗原酶联免疫试剂,开发了胶体金检测试剂,有效提高了HEV的检测灵敏度和特异性,2018年血清抗原检测已被欧洲肝病学会列为戊肝诊断的推荐指标之一。近期,研究团队在进一步的研究后发现,患者血液中存在的大量pORF2S会特异性聚集到肾脏,并在患者尿液中形成富集,为未来HEV的病原体临床检测指示了更为高效的新靶标,同时还揭示了尿液抗原的主要存在形式及代谢来源。

该研究通过对急慢性戊肝患者尿液中的HEV pORF2抗原进行半定量评估,发现在HEV感染者的尿液中存在大量的pORF2抗原,其平均水平甚至达到了血清抗原平均水平的80倍左右。在病毒复制期,患者尿液抗原的阳性率达95.7%,显著高于血清抗原阳性率(72.3%)及RNA阳性率(70.2%)。对急性戊肝患者的连续跟踪监测还显示出尿液抗原的检出率也明显优于血清抗原、血清核酸以及粪便核酸等所有病原体相关指标。动物感染模型进一步显示,尿液抗原阳性期与HEV的排毒周期高度一致,在感染早期就可以明显检出,并在病毒排毒结束后同时阴转,尿液抗原的阳性期比血清抗原及血清RNA均提前了6天。以上结果明确指示出尿液pORF2抗原是HEV现症感染的高灵敏度诊断靶标。

进一步研究显示,戊肝患者尿液中的pORF2蛋白是单体大小为20 kDa的二聚体蛋白,可鉴定区域(a.a.453-606)完整包含病毒pORF2蛋白的E2s结构域,并且未检测到糖基化修饰。小鼠尾静脉注射模型进一步提示,尿液pORF2抗原的主要来源是血液中的HEV的分泌型蛋白pORF2S,这是迄今为止明确发现的唯一能特异性地在无肾脏病理损伤情况下经血液进入尿液的病原体蛋白。研究发现pORF2蛋白E2s结构域上以Y485、E572、N573、R578等氨基酸位点构成的C6表位区介导了该蛋白在肾脏的近端肾小管细胞的特异性富集。这一过程很可能依赖于该类细胞基底面细胞膜表面受体引发的内吞及转运,最终经细胞顶面分泌进入尿液中,抗原在该过程也被进一步处理形成尿液中的20kD无糖基化修饰的二聚体形式。

尿液抗原检测具有优异的灵敏度和特异性,同时采样便捷、无创。夏宁邵教授团队和万泰生物联合研发的戊肝尿液抗原快速检测试剂(Clin Biochem,2018),有望在15分钟内完成检测,对戊肝的临床检测具有重要意义。该试剂目前已提交国家药监局注册申请,正处于审批阶段。

近日该研究成果以题为“Urine Is a Viral Antigen Reservoir in Hepatitis E Virus Infection”的研究论文在线发表于Hepatology。该研究是实验室针对戊肝病毒pORF2抗原及临床诊断应用系列研究的一部分,也是近年来在JCM(2015)、EMI(2018)、Clin Biochem(2018)和PNAS(2018)上发表戊肝抗原诊断及戊肝分泌型蛋白等相关研究论文后的又一项重要研究成果。国家工程中心博士生应东,北京大学博士生何启瑜,国家工程中心硕士生田玮琨、硕士生陈燕玲为该论文共同第一作者。国家工程中心夏宁邵教授、郑子峥副教授,北京大学王麟副研究员,国家工程中心唐自闽博士后为该论文的共同通讯作者。该研究获得了国家自然科学基金和中国科学技术协会青年人才托举工程的支持。

论文链接:https://aasldpubs.onlinelibrary.wiley.com/doi/abs/10.1002/hep.32745

(图/文 国家传染病诊断试剂与疫苗工程技术研究中心)

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